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產(chǎn)品介紹：             

實(shí)驗(yàn)操作

1. TRAzol的使用量情況如下。

樣品量

10 cm2的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

107的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

100 μl的白細(xì)胞

50～100 mg的普通組織樣品

50～100 mg的特殊組織樣品（肝、脾、骨及軟骨等）

15～30 mg的植物材料（多糖和多酚含量不高的）

2. 實(shí)驗(yàn)樣品的研磨和勻漿。

A. 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

① 倒出培養(yǎng)液，用1×PBS清洗一次。

② 每10 cm2生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞中加入1 ml的TRAzol，水平放置片刻，使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面并裂解細(xì)胞，然后使用移液槍吹打細(xì)胞使其脫落(對(duì)于貼壁牢固的培養(yǎng)細(xì)胞可用細(xì)胞刮勺剝離細(xì)胞)。

③ 將內(nèi)含細(xì)胞的裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀。

④ 室溫靜置5分鐘。

B. 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

① 將懸浮培養(yǎng)細(xì)胞連同培養(yǎng)液一起倒入離心管中，8,000 g 4℃離心2分鐘，棄上清。

② 向每107個(gè)細(xì)胞中加入l～2 ml的TRIzol。

③ 用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀。

④ 室溫靜置5分鐘。

C. 動(dòng)物組織、植物材料樣品

① 將超低溫凍結(jié)的RNA提取樣品稱量后迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀(無明顯的可見顆粒，如果沒有研磨徹底會(huì)影響RNA的收率和質(zhì)量)。

② 對(duì)于普通的RNA提取樣品，可以向研缽中加入適量的TRAzol，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。

   對(duì)于特殊樣品，如肝、脾、骨及軟骨等，可以將研磨成粉末狀的樣品加入到含有適量的TRAzol的勻漿管中，把勻漿管置于冰浴中進(jìn)行勻漿，直至勻漿液呈無顆粒透明狀。

③ 將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5分鐘。

④ 12,000 g 4℃離心5分鐘。

⑤ 小心吸取上清液，移入新的離心管中(切勿吸取沉淀)。

3. Total RNA的提取。

① 向上述步驟2的勻漿裂解液中加入氯仿(TRAzol的1/5體積量)，蓋緊離心管蓋，用力振蕩(氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，振蕩時(shí)應(yīng)小心離心管蓋突然彈開)。待充分乳化溶液呈乳白狀(無分相現(xiàn)象)后，再室溫靜置5分鐘。

② 12,000 g 4℃離心15分鐘。

③ 從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，即：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中(切忌吸出白色中間層)。

④ 向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15～30℃下靜置10分鐘。

⑤ 12,000 g 4℃離心10分鐘。一般在離心后，試管底部會(huì)出現(xiàn)沉淀。

4. RNA沉淀的清洗。

   小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75％的乙醇l ml(切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12,000 g 4℃離心5分鐘后小心棄去乙醇(為了更好地控制RNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇)。

5. RNA的溶解。

   室溫干燥沉淀2～5分鐘(不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會(huì)很難溶解，有關(guān)RNA溶解可以參考Troubleshooting中的相關(guān)說明)，加入適量的RNase-free水溶解沉淀，必要時(shí)可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

　注意事項(xiàng)：

  ● RNA樣本保存液如出現(xiàn)沉淀，37℃加熱振蕩混勻。

  ● 加入RNA樣本保存液后，樣本不能立即置于-20℃或-80℃，要先4℃置放過夜，待組織充分浸潤(rùn)后再置于低溫保存。

  ● 樣品浸沒在RNA樣本保存液中，可在37℃保存1天，25℃保存1周，4℃保存1個(gè)月，-20℃長(zhǎng)期保存；使用時(shí)請(qǐng)注意保存時(shí)限。

  ● 保存在RNA樣本保存液中的樣本可不經(jīng)特殊處理，離心或直接使用和新鮮組織一樣的RNA提取方法提取RNA。

  ● RNA樣本保存液可以配合各種常見的RNA提取試劑盒使用，如東盛、invitrogen、omega等公司出品的RNA提取試劑盒，不影響試劑盒操作，不影響提取所得RNA質(zhì)量及其后續(xù)實(shí)驗(yàn)。